【研究成果】純国産ゲノム編集ツール「Zinc Finger-ND1」の高機能化に成功～産業応用可能なゲノム編集法として期待～

本研究成果のポイント

ゲノム編集ツール「Zinc Finger-ND1」を効率よく作製する方法を発見し、またその機能の向上に成功しました。
ゲノム編集の産業利用への一助となることが期待されます。

概要

　広島大学ゲノム編集イノベーションセンターの片山翔太特任准教授、山本卓教授、医系科学研究科の野村渉教授、産業技術総合研究所の渡邊真宏主任研究員、加藤義雄グループ長らのグループは、構造モデリングに基づく改変により、純国産ゲノム編集ツール「Zinc Finger-ND1」の高機能化に成功しました。
　本研究成果は、「Advanced Science」（IF=15.1）に令和６年４月11日付でオンライン掲載されました。

発表論文

論文タイトル: Engineering of Zinc Finger Nucleases through Structural Modeling Improves Genome Editing Efficiency in Cells

著者: 片山　翔太１,＊、渡邊　真宏２、加藤　義雄３、野村　渉４、山本　卓１, ５, *

１．    広島大学ゲノム編集イノベーションセンター
２．    産業技術総合研究所機能化学研究部門バイオ変換グループ
３．    産業技術総合研究所バイオメディカル研究部門構造創薬研究グループ
４．    広島大学大学院医系科学研究科
５．    広島大学大学院統合生命科学研究科
＊    責任著者

掲載雑誌: Advanced Science (IF=15.1)(Q1)

DOI: 10.1002/advs.202310255

この研究成果は、COI-NEXT「バイオDX産学共創拠点」の支援を受けて研究を行い、得られたものです。

背景

　標的DNAを改変するゲノム編集ツールは、遺伝子細胞治療のための強力なツールです。主なゲノム編集ツールとして、最も使われているCRISPR-Cas、次に使われているTALEN、最も使われていないZFN等があり、そのうち、CRISPR-CasやTALENは基本特許が２０３０年以降まで継続しているため、医療分野への使用には高額なライセンスフィーの支払いが必要です。一方、ZFNは基本特許が２０２０年までに切れており、ライセンスフリーで使用できるゲノム編集ツールです。DNAを認識するZinc FingerとDNAを切断するFirmCutND1 Nuclease（広島大学で独自に開発）を組合わせることにより、純国産ゲノム編集ツール「Zinc Finger-ND1」を作製することができます。しかし、機能的なZFNを構築し、そのゲノム編集効率を向上させることは非常に困難でありました。

研究成果の内容

　ZFNの作製は、従来、無作為に並べ替えたZFから標的DNAに結合するZFを取ってくるスクリーニングによるものが主流でした。しかし、機能的なZFNの作製までに２ヶ月ほどの時間を要し、かなりの時間と労力を要するものでした。また、ZFを遺伝子工学的に連結させるModular Assemblyと呼ばれる方法も考案されましたが、3-finger ZFN（ZFを３つ連結）を作製した場合、機能的なZFNが得られる確率が５％程度であり、作製効率が悪く使い物になりませんでした。我々は、Fingerの数が少ないことで認識する塩基数が少なくなり、機能的なZFNの作製効率の低下をもたらしていると考えました。そこで、本研究では、6-finger ZF-ND1（図１）をModular Assemblyを用いて作製し、認識する塩基数を多くしました。その結果、作製した１０個のZF-ND1の中で、２個のZF-ND1でゲノムDNA切断活性を確認、つまり、２０％の確率で機能的なZFNを得ることに成功しました。
　ZF-ND1の機能をより高めるべく、我々は、構造モデリングの手法（AlphaFold, Rossetta, Cootによる分子モデリング）を用いて、ZFとDNAの相互作用をモデリングしました（図２）。Zif268（DNAに結合する天然の3-finger ZF）のDNAとの相互作用のモデルと比較して、５個の変異導入候補が同定されました。さらに、Zif268のDNA sugar-phosphate backboneと結合するアミノ酸と比較して、４個の変異導入候補が同定されました。これら９個の変異候補を１つ１つ機能的なZF-ND1に導入したところ、３個の変異（図３）でゲノムDNA切断活性の向上が見られました。V109K変異においては、５％の切断活性の向上が見られ、構造モデリングに基づく、ZF-ND1の高機能化に成功しました。

今後の展開

　高機能化したZF-ND1は、ex vivo（がん治療や再生医療用の細胞作り）/in vivo（生体内）ゲノム編集治療に用いることができるものと考えられます。広島大学ではこれまでも、「Platinum TALEN」というゲノム編集ツールを独自に作成し、基礎研究において活用してきましたが、今回の高機能化したZF-ND1を活用することにより、高額なライセンス料を回避することができるため、ゲノム編集の産業利用への一助となることが期待されます。